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      抗體常見問題解答Technical frequently asked questions (FAQs)
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      常見問題:

      1. 如何選擇合適的一抗?
      2. 如何選擇合適的二抗?
      3. 如何選擇合適的同型對照?
      4. 如何選擇陽性對照?
      5. 如何確定一抗的稀釋比例?
      6. 如何選擇合適的抗原修復方式?
      7. 為何WB檢測條帶大小與預期有差別?
      8. 抗體能夠用于其他種屬/實驗方法?
      9. 如何確定抗體是否能用于未經驗證的種屬?
      10. 抗體能否與該蛋白的其它亞型或同一家族其他蛋白交叉反應?
      11. 如何保存抗體?
      12. 如何分裝抗體?
      13. 能否提供抗體的免疫原序列?

      1、如何選擇合適的一抗?

      請先確定您要檢測的種屬和使用的實驗方法,然后查找相關產品,根據說明書上描述的“適用種屬和實驗方法”來確定合適的抗體。如果說明書中有明確您要檢測的種屬和實驗方法均經過檢測,則您可以放心地購買該產品。如果說明書中沒有注明您用的種屬和實驗方法經過驗證,那么請參考第8、9、10條。

      Abcam網站所有說明書都是根據驗證情況(Abcam實驗室以及客戶)實時更新的,所以可以放心參考!

      2、如何選擇合適的二抗?

      二抗的選擇原則:

      • 針對一抗來源的二抗(比如一抗是小鼠來源的,二抗就要是抗小鼠的)
      • 針對一抗Ig亞型的(比如一抗是IgM,二抗就要是抗IgM的抗體)
      • 為了增加特異性、降低背景:可以選擇Fab段的抗體(去除Fc段的)、經過標本來源種屬血清吸附的的二抗
      • 查看二抗的說明書,選擇經過驗證可以用于相應實驗方法的二抗

      Abcam提供各種種屬、各種類型和標記的二抗,完全滿足您實驗的需要:

      • 可以通過一抗說明書頁面的“Related Products”來選擇合適的二抗
      • 通過產品分類目錄選擇合適的二抗

      3、 如何選擇同型對照?

      同型對照的主要目的是確定一抗的結合是特異性的,而不是非特異性的Fc受體或與其他蛋白的相互作用。同型對照要與一抗的來源、Ig分型和標記完全一致。例如:一抗是FITC標記,其抗體分型是小鼠的IgG1,則同型對照要選擇是FITC標記的小鼠的IgG1。

      Abcam提供各種種屬和Ig分型的同型對照產品,可以在Abcam和51AB的網站,產品分類“Isotype”/“同型對照”中查找和選擇合適的產品

      多抗的同型對照:

      絕大部分的同型對照產品都是單克隆抗體,因此不適用于作為多克隆抗體的對照(因為多抗含有多種IgG的亞型)。Abcam同樣提供了幾種多抗的同型對照產品,滿足實驗者的需要。

      4、如何選擇陽性對照?

      陽性對照的使用是一個實驗中確定抗體及檢測系統是否正常工作的依據,也是確定待測標本中是否存在待測蛋白的一個依據!尤其是檢測的標本是不確定是否有待測蛋白表達時。因此當實驗沒有陽性結果出現時,最好的選擇是實驗合適的陽性對照。

      大部分Abcam的說明書上都有推薦的陽性對照。但是如果說明書上沒有推薦時,請參考以下條款:

      • 看看說明書中是否有Abreviews。任何被其他客戶成功檢測的組織、細胞或者裂解物均可以作為合適的陽性對照!
      • 根據說明書上的Swiss-ProtOmnigene 數據庫來查找。這些數據庫經常會列出該蛋白表達的組織,這也可以作為合適的陽性對照!
      • 查查該蛋白的GeneCards 吧,這里通常會有蛋白在不同組織的表達水平。
      • 如果上述方法還是不能找到合適的陽性對照,推薦您去PubMed 查查發表文章,看看有無文章報道該蛋白表達的細胞和組織

      5、如何確定一抗的稀釋比例?

      如果說明書中有推薦的稀釋比例,請按照該稀釋比例進行實驗。但是由于標本類型、實驗條件、操作環境等各種因素的影響,推薦濃度僅作為參考。實驗者需要在推薦濃度周圍進行多個濃度梯度的實驗,從中發現最佳的稀釋比例。

      如果說明書沒有推薦稀釋比例,僅注明“Use at an assay dependent dilution”,就需要做大量的預實驗來摸索最佳的比例了。下表列出的純化抗體抗體用于不同實驗方法時常用的工作濃度,可以作為預實驗的參考。未純化的抗體一般在說明書中不會標明抗體的濃度,因為大部分全抗血清、培養上清或腹水形式的產品濃度都是沒有經過測定的。如果未純化抗體產品的說明書中沒有標明其中特異性抗體的濃度,實驗者可以參考下表中“估計濃度”確定各種實驗稀釋比例。

      請記住,下表中的各種稀釋比例和工作濃度僅僅是作為一個起始點,需要根據試驗結果來進行適當的調整。最好以此起點作一系列的濃度,從中確定最佳的工作濃度和稀釋比例!

       
      組織培養上清
      腹水
      全抗血清
      純化抗體
      WB / dot blot
      1/100
      1/1000
      1/500
      1 ug/ml
      IHC / ICC
      neat - 1/10
      1/100
      1/50 - 1/100
      5 ug/ml
      EIA / ELISA
      1/1000
      1/10000
      1/5000
      0.1 ug/ml
      FC
      1/100
      1/1000
      1/500
      1 ug/ml
      IP
       
      1/100
      1/50-1/100
      1 - 10 ug/ml
      Concentration estimate
      1 - 3 mg/ml
      5 - 10 mg/ml
      1 - 10 mg/ml
       

      6、如何確定適用于某種特定抗體的抗原修復方法?

      有些抗體對抗原修復方式有特別要求的,一般在其說明書中都會有明確的標注和推薦。但是很多抗體并沒有一個特別的推薦,就需要實驗者自己來進行優化和摸索了?梢詤⒖51AB網站實驗方法中“免疫組化實驗方法”以及abcam網站的的IHC protocols page 查看更多的抗原修復方法

      7、為何實際檢測到的WB條帶與預期的有所區別?

      WB是根據蛋白質的大小來分離蛋白的,通常小分子量蛋白在凝膠中的遷移速度要快。但是遷移率也是受到其他因素影響的,這就造成了實際檢測到的條帶與預期條帶的不一致。主要有以下幾種常見因素:

      • 翻譯后修飾-比如磷酸化、糖基化等,這些修飾會增加蛋白質的分子量
      • 翻譯后剪切- 比如很多蛋白是以前體蛋白的形式合成的,在執行功能時需要進行剪切成活化的形式,如pro-caspases
      • 不同剪切體 – 有些來源于同一基因的蛋白有不同的剪切方式,每個剪切方式得到的蛋白大小都是不同的
      • 相對電荷(Relative charge – 氨基酸的組成(charged vs non-charged)
      • 多聚體-如二聚體或三聚體。這些多聚體的形式通常會抵制WB時所做的還原條件,因此造成檢測的條帶偏大。

      8、抗體是否能用于其他種屬/實驗方法?

      關于某個抗體所有經過檢測的種屬和用途都標明在說明書上,并且會根據最新驗證情況及時得到更新。

      如果您希望購買某個產品用于未經驗證的種屬或者用途,我們鼓勵您使用并將實驗結果通過在線Abreview來發表(不論是陽性還是陰性的結果),這些結果會對其他的客戶起到參考的作用。對于每篇評論,我們會提供相應的積分(Abpiont),可以用于兌換禮品或折扣券來進行下次購買產品

      9、如何確定某個抗體是否能用于未經驗證的種屬?

      Abcam不能保證某個抗體能夠成功的用于未經我們驗證的種屬,即使其序列同源性很高。因為一個抗體能否用于檢測其他種屬的影響因素是非常多的。

      如果沒有其他的選擇,您需要考慮購買抗體用于未經檢測的種屬時,推薦您先確定下該抗體所用免疫原與您要檢測蛋白的序列同源性。您可以通過網上說明書中“Swiss-Prot ”來檢測,也可以通過其他網站來查找。如:EMBL-EBI,將說明書中的抗體免疫原序列和您要檢測蛋白的序列輸入后比較相同性。如果相同性超過85%,則該抗體能成功檢測您要測蛋白的可能性會比較高;但是,即使序列相同性超過85%,我們也不能保證該抗體一定能成功用于您的實驗。

      10、抗體能否與該蛋白的其它亞型或同一家族其他蛋白交叉反應?

      對于一些抗體,說明書中明確指出了與其他蛋白的交叉反應(在‘specificity’ 項里)。如果說明書中沒有相關信息的話,我們推薦您比較該抗體的免疫原序列和其他您希望了解的蛋白序列。您可以通過以下網站來進行序列的比較:EMBL-EBI 將說明書中的抗體免疫原序列和您要比較蛋白的序列輸入后比較相同性。如果相同性超過85%,則該抗體與比較蛋白交叉反應的可能性會比較高;如果要確定沒有交叉反應,則比較出來的同源性要非常低才行。

      11、如何保存抗體?

      我們堅持推薦您按照說明書上的推薦的儲存方式來保存抗體。如果您沒有按照要求來保存抗體,那么我們很難保證抗體的效果

      請仔細閱讀我們的抗體保存指南

      12、如何分裝抗體?

      請根據一次實驗的用量來分裝抗體,但是每份不應該少于10ul。分裝的體積越小,抗體濃度受蒸發和管壁吸附的影響越大。

      請仔細閱讀我們的抗體保存指南

      13、是否能夠提供抗體的免疫原序列?

      有些抗體其免疫原序列并不會標明在說明書上。因為篩選合適的免疫原以產生最有效的抗體,其工作量是非常之大的,因此有時這些序列只有在客戶特別索取時,才提供。對于某些非Abcam自產的抗體,免疫原序列是商業機密,很抱歉我們不能提供給您(即使單獨索。

      對于特異性表位(免疫原中的抗體結合區)基本上不會提供的,因為這是最核心的商業機密。

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